方案摘要：本方案全面覆盖猪圆环病毒实时荧光 PCR 检测全流程，依托 Pipetty 电动移液器精准定量、程序记忆等核心优势，对试剂混匀、批量加样等关键环节进行标准化流程优化。设备移液精度优异、运行稳定性高，既能有效规避人工移液操作误差，又可减轻长时间实验的手部劳作疲劳。显著提升实验重复性与批次检测一致性，统一规范全套检测操作流程，为猪圆环病毒病原确诊、流行病学调查及日常常态化筛查，提供精准高效、质控稳定的专业实验保障。
 
方案详情：
一、实验原理
本试验基于实时荧光 PCR 技术，针对猪圆环病毒特异性基因片段设计引物与荧光探针。PCR 扩增过程中探针与目标基因特异性结合，随扩增循环进行，荧光信号同步累积增强。仪器实时检测荧光强度变化，通过荧光扩增曲线判定样本是否含病毒核酸。结合标准曲线可实现病毒定性检测与定量分析，具有灵敏度高、特异性强、检测快速的特点，适用于猪圆环病毒临床疫病筛查与病原确诊。
二、实验准备
1、器材
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 荧光PCR仪；
③ 荧光PCR管；
 
 
2、试剂
① PBS；
② DNAzol；
③ 无水乙醇；
④ 75%乙醇；
⑤ 8 mmol/L NaOH；
⑥ 10×PCR buffer；
⑦ dNTPs；
⑧ Taq 酶(5U/uL)；
⑨ 无核酸酶水；
⑩ 阳性对照；
⑪ 阴性对照；
⑫ 引物及探针。
 
三、实验步骤
1、样品制备：取待检组织样品约1g~3g置于组织匀浆机中充分研磨，用PBS制备成10%的组织匀浆液。2 000r/min离心10min，取上清液，待检。血清样品可直接用于检测。
2、核酸提取
a） 取若干个灭菌的1.5mL离心管,其中n为待检样品数+阳性对照数+阴性对照数，对每个离心管进行编号。
b) 使用Pipetty每管先加入800uL DNAzol,再分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200uL,振荡混匀15 s,2 ℃~8 ℃或室温 10 000 r/min 离心10 min。
c) 取900uL上清液，置于新的1.5mL灭菌离心管中,加入500uL无水乙醇，混匀，室温放置3 min;2 ℃~8 ℃或温 10 000 r/min 离心 5 min.
 
d) 弃上清液,沿管壁缓缓加入0.8mL~1mL75%乙醇,颠倒3次~6次混匀，2℃~8℃10 000r/min离心5min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器吸去残液。
e) 用30uL 8mmol/LNaOH溶液溶解沉。DNA在2℃~8℃可保存两个月,-20℃可稳定保存两年。
2、反应体系配制
使用Pipetty电动移液器，按照表 2配制25μl Real-timePCR反应体系。再用Pipetty的连续分液功能，加入96孔板中，每次扩增应设置阳性对照和阴性对照。
 
 
3、反应程序设置
将试剂充分混匀,盖紧荧光PCR管盖,瞬时离心后,置于荧光 PCR 仪中进行扩增。扩增程序为:95℃预变性2min;95℃变性15s,60℃退火延伸30s,40个循环。在扩增阶段每次循环的60 ℃ 退火延伸时收集荧光信号。
 
四、实验成立条件
阳性对照 25≤Ct值≤28且出现特异性扩增曲线,阴性对照无 Ct值或 Ct值≥40且无特异性扩增曲线,则试验结果有效;否则应重新进行试验。
五、结果判定
被检样品的Ct值≤36且出现特异性扩增曲线,判定为PCV2核酸阳性,检测结果见C.5;被检样品无 Ct值或 Ct值≥40且无特异性扩增曲线,判定为PCV2核酸阴性;当被检样品36