方案摘要：本方案覆盖猪圆环病毒全套鉴定实验流程，依托 Pipetty 电动移液器高精度定量、程序记忆储存等核心优势，对试剂梯度稀释、批量加样等关键环节进行流程优化。Pipetty移液量精准稳定，可有效规避人工操作误差，同时减轻长时间实验的操作疲劳。显著提升实验重复性与批次均一性，稳定把控检测质量、规范标准化操作流程，为动物疫病病原分离鉴定、流行病学调查及常态化病原监测，提供高效稳定、精准可靠的技术保障。
 
方案详情：
一、实验原理
IFA 即间接免疫荧光检测，基于抗原抗体特异性免疫结合与荧光标记显色原理。将待检样品接种细胞培养并制备抗原玻片，加入猪圆环病毒特异性一抗，若样品含病毒则与细胞内病毒抗原特异性结合；再加入荧光标记二抗，与一抗结合。荧光显微镜下观察，感染病毒的细胞会呈现特异性荧光，根据荧光有无、强弱即可判定猪圆环病毒感染情况。
二、实验准备
1、器材
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 生物安全柜；
③ 二氧化碳培养箱；
④ 倒置荧光显微镜；
⑤ 台式低速离心机；
⑥ 组织匀浆机或研磨器；
⑦ 细胞培养瓶；
⑧ 96孔细胞培养板。
 
 
2、试剂
① MEM；
② PBS；
③ 4%多聚甲醛；
④ 细胞生长液；
⑤ 细胞维持液；
⑥ 300mmol/LD-氨基葡萄糖；
⑦ 0.1%TritonX-100；
⑧ 3%BSA；
⑨ 3%H₂O₂-甲醇溶液；
⑩ 小鼠抗PCV2单克隆抗体；
⑪ FITC-山羊抗小鼠IgG抗体；
⑫ DAPI染色液；
⑬ HRP-山羊抗小鼠IgG抗体；
⑭ AEC显色试剂盒；
⑮ PK-15细胞。      
 
三、实验步骤
1、消化对数生长期的 PK-15细胞,使用Pipetty电动移液器的一键混匀功能，用细胞生长液稀释成1×105个/mL，切换连续分液模式，等量加入100uL/孔铺于96孔细胞培养板。
2、使用Pipetty将待检病毒液接种长至单层的PK-15细胞，100uL/孔。同时设置已知PCV2病毒接种孔作为阳性对照，100uL/孔;设置细胞维持液接种孔作为阴性对照，100uL/孔。
 
3、将细胞培养板置于37℃、5%(体积分数)二氧化碳培养箱中孵育1h，弃去病毒液，用PBS清洗2次，3min/次，弃净，每孔加入细胞维持液 100uL,继续培养48h。
4、弃上清，用PBS冲洗细胞3次，每孔加入100uL 4%多聚甲醛,室温固定20min,弃液，PBS冲洗细胞3次，每次3min,轻轻拍干。
5、使用Pipetty每孔加入100uL 0.1% Triton X-100室温透膜 10 min,弃液,用PBS冲洗细胞3次，3min/次，轻轻拍干。
6、使用Pipetty每孔加入100uL 3% BSA，室温封闭1h,弃上清。
7、使用Pipett每孔加入50uL小鼠抗PCV2单克隆抗体(稀释至工作浓度)，37℃作用1 h，弃液，用PBS冲洗细胞3次，3min/次，轻轻拍干。
 
8、使用Pipett每孔加入50uL FITC-山羊抗小鼠IgG(稀释至工作浓度),37 ℃避光反应1h，用PBS 冲洗细胞3次，3min/次，轻轻拍干。
9、使用Pipett每孔加入50 uL DAPI 染色液，室温避光反应5 min,弃液，用PBS冲洗细胞3次3 min/次，拍干。将 96孔细胞培养板置于倒置荧光显微镜下观察。
四、实验成立条件
阳性对照细胞出现亮绿色特异性荧光，且阴性对照细胞未出现亮绿色特异性荧光。
五、结果判定
被检病毒接种的细胞出现亮绿色特异性荧光，判定为PCV2阳性;被检病毒接种的细胞未出现亮绿色特异性色荧光，判定为PCV2阴性。