高热酸性古菌蛋白酶可显著提高质谱蛋白质从头测序的效率和准确性
2026-08-07 来源:本站 点击次数:226
蛋白质从头测序可在无参考基因组数据库的情况下，直接从质谱数据推导氨基酸序列，在抗体测序、微生物蛋白质组学、抗原发现等场景中具有不可替代的作用。人类抗体具有丰富的多样性，大部分抗体具有共同结构和构象，但由于功能差异，每种抗体又都拥有独特的序列，尤其是负责抗原结合的互补决定区（CDR）序列高度可变，一直是蛋白质测序的难点与盲区。
传统质谱测序技术常用的胰酶等特异性蛋白酶进行酶解，但这种方法存在肽段覆盖不全、长肽碎裂效率低、流程繁琐等局限。目前主流方法常采用多种蛋白酶并行处理，虽然可以显著提升总体序列覆盖，但极大地增加了样品处理复杂度、实验成本和分析时间，一定程度上限制了从头测序的通量和应用广泛性。因此，将实验步骤最大限度地简化并提升效率，将成为突破抗体从头测序瓶颈的关键。
2026年 Albert J.R. Heck 团队在 Cell Systems 发表题为 “Deep coverage and extended sequence reads obtained with a single archaeal protease expedite de novo protein sequencing by mass spectrometry” 的文章。团队基于从古菌中提取的耐高温酸性（HTA）蛋白酶联合EAciD混合碎裂的全新策略，为抗体从头测序提供高效、精准、简化的解决方案。数据分析借助 PEAKS® Studio 软件完成。
传统质谱测序技术常用的胰酶等特异性蛋白酶进行酶解，但这种方法存在肽段覆盖不全、长肽碎裂效率低、流程繁琐等局限。目前主流方法常采用多种蛋白酶并行处理，虽然可以显著提升总体序列覆盖，但极大地增加了样品处理复杂度、实验成本和分析时间，一定程度上限制了从头测序的通量和应用广泛性。因此，将实验步骤最大限度地简化并提升效率，将成为突破抗体从头测序瓶颈的关键。
2026年 Albert J.R. Heck 团队在 Cell Systems 发表题为 “Deep coverage and extended sequence reads obtained with a single archaeal protease expedite de novo protein sequencing by mass spectrometry” 的文章。团队基于从古菌中提取的耐高温酸性（HTA）蛋白酶联合EAciD混合碎裂的全新策略，为抗体从头测序提供高效、精准、简化的解决方案。数据分析借助 PEAKS® Studio 软件完成。
研究方法
研究混合了四种已知序列的单克隆抗体（Cetuximab, Trastuzumab, NISTmAb, F59）模拟多克隆混合物，将两种超热酸性古菌蛋白酶（HTA）Krakatoa和Vesuvius与传统胰蛋白酶和糜蛋白酶进行对比。使用ZenoTOF 7600系统，对比了 CID、EAD 以及两者结合的混合模式 EAciD 的性能差异。通过数据库搜索评估肽段覆盖度和重叠程度，并利用 PEAKS® Studio 软件进行肽段从头测序。完成抗体序列拼接后，从冗余度、比对得分、错误率三个维度评估测序准确性。
图 1 三种碎裂模式（CID、EAD、EAciD）的性能评估
HTA蛋白酶显著提升肽段数量与序列覆盖度
基于数据库匹配结果，HTA 蛋白酶展现出远超传统蛋白酶的酶解性能：其生成的独特肽段数量约为胰蛋白酶的5倍，并且肽段长度更长、电荷分布更广，肽段长度中位数达到26个氨基酸，更有利于长序列覆盖（图2）。
图2 四种蛋白酶平行消化后单克隆抗体混合物的肽段数据：胰蛋白酶（紫色）、糜蛋白酶（蓝色）、Vesuvius（粉色）和 Krakatoa（橙色）
肽段覆盖的冗余度是评估从头测序可信度的关键指标，单氨基酸位点的覆盖冗余度越高，测序置信度与氨基酸位点准确性越强。图 3 统计结果表明，HTA蛋白酶的单氨基酸覆盖冗余度中位数高达 23–24，而胰蛋白酶仅为 1、糜蛋白酶为3，并且HTA蛋白酶可实现抗体全序列覆盖，CDR区域达到高度冗余覆盖。
图3 单氨基酸位点的冗余测序读数
从头测序准确性显著提高
由于数据库匹配只能对已知序列的样本进行评估，为了模拟未知蛋白测序流程，团队使用这批数据，在PEAKS® Studio 中完成非数据库依赖的从头测序，解析出数据中的全部潜在多肽，然后自行完成整体蛋白序列拼接。
结果显示（图4A-E），与传统蛋白酶相比，HTA蛋白酶的冗余读数中位数提高了三倍以上，序列比对分数提升四倍，拼接错误率则降低了四倍。这一系列数据表明，HTA蛋白酶联合EAciD碎裂技术为抗体可变区提供了高置信度的序列信息，显著提升了从头测序的准确性与可靠性。
图4(A-D) HTA 蛋白酶与 EAciD 结合提供冗余和可靠的从头测序读数
实验流程的简化与效率提升
图4E HTA与常规酶切实验对比
文献信息
标题: Deep coverage and extended sequence reads obtained with a single archaeal protease expedite de novo protein sequencing by mass spectrometry
期刊: Cell systems
DOI: 10.1016/j.cels.2026.101536
研究结果
EAciD 显著提升肽段鉴定效率
研究对比了CID、EAD和EAciD三种碎裂模式。结果显示（图1），EAciD混合碎裂模式表现最优。该模式能够产生b/y离子和c/z离子，以及能够区分亮氨酸和异亮氨酸的特征离子，极大丰富了谱图中的碎片离子信息，为后续从头测序提供高质量谱图基础。
研究对比了CID、EAD和EAciD三种碎裂模式。结果显示（图1），EAciD混合碎裂模式表现最优。该模式能够产生b/y离子和c/z离子，以及能够区分亮氨酸和异亮氨酸的特征离子，极大丰富了谱图中的碎片离子信息，为后续从头测序提供高质量谱图基础。
图 1 三种碎裂模式（CID、EAD、EAciD）的性能评估
HTA蛋白酶显著提升肽段数量与序列覆盖度
基于数据库匹配结果，HTA 蛋白酶展现出远超传统蛋白酶的酶解性能：其生成的独特肽段数量约为胰蛋白酶的5倍，并且肽段长度更长、电荷分布更广，肽段长度中位数达到26个氨基酸，更有利于长序列覆盖（图2）。
图2 四种蛋白酶平行消化后单克隆抗体混合物的肽段数据：胰蛋白酶（紫色）、糜蛋白酶（蓝色）、Vesuvius（粉色）和 Krakatoa（橙色）
肽段覆盖的冗余度是评估从头测序可信度的关键指标，单氨基酸位点的覆盖冗余度越高，测序置信度与氨基酸位点准确性越强。图 3 统计结果表明，HTA蛋白酶的单氨基酸覆盖冗余度中位数高达 23–24，而胰蛋白酶仅为 1、糜蛋白酶为3，并且HTA蛋白酶可实现抗体全序列覆盖，CDR区域达到高度冗余覆盖。
图3 单氨基酸位点的冗余测序读数
从头测序准确性显著提高
由于数据库匹配只能对已知序列的样本进行评估，为了模拟未知蛋白测序流程，团队使用这批数据，在PEAKS® Studio 中完成非数据库依赖的从头测序，解析出数据中的全部潜在多肽，然后自行完成整体蛋白序列拼接。
结果显示（图4A-E），与传统蛋白酶相比，HTA蛋白酶的冗余读数中位数提高了三倍以上，序列比对分数提升四倍，拼接错误率则降低了四倍。这一系列数据表明，HTA蛋白酶联合EAciD碎裂技术为抗体可变区提供了高置信度的序列信息，显著提升了从头测序的准确性与可靠性。
图4(A-D) HTA 蛋白酶与 EAciD 结合提供冗余和可靠的从头测序读数
实验流程的简化与效率提升
除了数据质量方面的优势，HTA蛋白酶在实验操作上更具简便性。传统蛋白酶需要过夜消化（约 12-16 小时）、且还需变性、还原等繁琐步骤，而HTA蛋白酶在高温（80°C）和酸性条件下仅需 20 分钟即可完成酶解。同时，这一环境本身就能使蛋白质变性，因此，实验无需额外添加变性剂，也省去了半胱氨酸烷基化步骤和大量的样品清洗纯化操作，缩短实验周期、降低操作难度。
图4E HTA与常规酶切实验对比
结论与意义
本研究从多个角度证实HTA蛋白酶/EAciD联用的方法显著提高了蛋白序列测定的准确性，同时简化了实验流程，提高样本前处理效率，整体表现可超越传统的多蛋白酶组合策略，为从头测序应用带来了重大进步。本研究仅基于抗体样本进行对比，但HTA蛋白酶在更广泛的Bottom up蛋白质组学中的同样具备可观的应用潜力。文献信息
标题: Deep coverage and extended sequence reads obtained with a single archaeal protease expedite de novo protein sequencing by mass spectrometry
期刊: Cell systems
DOI: 10.1016/j.cels.2026.101536
作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的PEAKS®️系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽组发现服务和抗体综合表征服务等。
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