关键词：肝细胞癌；质谱免疫肽组学；非经典新抗原

肝细胞癌（HCC）高发、致死率高、预后差。手术、放疗、靶向治疗对晚期患者生存获益有限，总体生存率低；新型免疫疗法应答率偏低，仅少数患者实现长期缓解。

鉴于现有疗法存在的短板，新抗原免疫治疗现已成为重要的突破方向。这种方法的疗效依赖高质量、高免疫原性的靶点，因此筛选包括非经典翻译在内的的隐蔽新抗原并验证其抗肿瘤效果是当下的研究重点。现有的依托全外显子组或RNA测序+生信预测鉴定得到的新抗原假阳、假阴性率高，抗原免疫原性弱；相比之下，质谱免疫肽组学可直接高通量分析细胞表面MHC呈递的抗原肽，规避预测偏差；搭配从头测序还能解析不同来源的翻译后修饰抗原肽，提高新抗原筛选的多样性与鉴定精度，利于发掘治疗靶点。

尽管质谱免疫肽组学已在多种实体瘤中成熟应用，但在肝细胞癌的相关研究中仍存在巨大空白。针对这一研究缺口，福建孟超肝胆医院的刘小龙研究团队在《Journal of Hepatology Reports》发表题为“Mass spectrometry-based de novo sequencing reveals non-canonical neoantigens with antitumor efficacy in hepatocellular carcinoma”的研究论文。该研究搭建了一套完整的HCC新抗原研究工作流，涵盖从新抗原鉴定到体内外抗肿瘤功效评估的全流程，为HCC非经典新抗原的全面筛查和精确鉴定提供了范例，有助于个体化免疫治疗的进步。

研究选用 PEAKS^® Online 软件完成免疫肽组学的质谱数据分析，其内置的DeepNovo Peptidome 工作流可以对免疫肽进行基于深度学习的从头测序，结合数据库搜索与序列变异分析，可鉴定标准经典参考数据库通常遗漏的变异序列与修饰序列，实现对免疫肽的深度挖掘分析。

  研究方案  

研究首先在 C57BL/6 小鼠皮下接种 Hepa1-6 肝癌细胞建立皮下 HCC 小鼠模型，并通过 MHC-Ⅰ免疫共沉淀富集免疫肽，结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术采集数据。

在数据分析层面，使用 PEAKS^® Online 软件进行免疫肽的深度鉴定。借助深度学习模型对上述鉴定肽段的免疫原性进行预测筛选，并通过体外 ELISPOT 实验验证各肽段激活特异性T细胞的能力，同时采用平行反应监测（PRM）靶向质谱技术，证实候选肽在肿瘤内的内源表达。最后分别筛选免疫原性最优的 7 条经典肽与 7 条非经典肽，并将其延伸为长肽，联合免疫佐剂 poly (I:C) 制备治疗性肽疫苗，在皮下、原位两种肝癌小鼠模型中同步评估各类疫苗的体内抗肿瘤功效。

  研究结果  

01--HCC的免疫肽组学特征

研究使用如下的工作流进行基于质谱的免疫肽组学分析（图1）。

图1. 小鼠皮下HCC模型中的免疫肽组学工作流程。

共鉴定到 5,576 条免疫肽，其中 4,663 个肽可匹配到经典蛋白数据库的参考蛋白，另有154条肽为单个氨基酸变异肽，这些基因组来源清晰的肽段归类为经典肽（PC）。其余 759 条免疫肽无法匹配到任何经典蛋白条目，归类为非经典肽(PNC)（图2A）。进一步追溯其基因组起源发现，这些非经典肽分别来源于内含子区域（59个）、转座子元件（43个）、转座子内的开放阅读框（25个）以及长链非编码RNA（1个），充分体现了非经典肽多样化的来源。

近半数鉴定的免疫肽已有公共存储库注释（图2B）；长度分析显示，73.5%的免疫肽由 8-9 个氨基酸组成，与 MHC-Ⅰ抗原肽的经典长度分布一致（图2C）。采用 Gibbs 无监督聚类分析肽段MHC结合基序，证实所有肽段均存在标准 MHC-Ⅰ结合特征，且经典与非经典肽结合基序高度一致；深度学习算法亲和力预测表明，约 56% 的免疫肽具备 MHC 结合活性，其中 73% 特异性结合 H2-Kb 等位基因（图2D），并且大多数肽段为 H2-Kb 和 H2-Db 的强结合配体（图2E），两种等位基因对抗原的识别存在高度特异性，体现不同 MHC-Ⅰ等位基因在抗原呈递方面的功能差异。

总体而言，这些结果证实了研究所用方法在识别 MHC 结合肽方面的有效性，并验证了该免疫肽组数据集的高质量。

图2. 小鼠肝细胞癌免疫肽组的整体特征

02--候选新抗原的筛选及其强免疫原性的体外验证

完成全面的免疫肽组学鉴定之后，研究团队以在 HCC 中特异性表达、长度为 8-10 个氨基酸以及最高 MHC 结合亲和力等为标准，筛选出 7 个 PCs 和 13 个 PNCs 作为候选肽段（图3A）。

为验证上述候选肽是否可用于治疗性肿瘤疫苗开发，研究选取 poly(I:C) 作为免疫佐剂，将合成肽与佐剂联合免疫小鼠，随后通过单一肽段体外再刺激检测肽段激活T细胞的能力（图3B）。免疫原性检测结果显示，仅1条非经典肽无明显免疫激活效果，其余所有候选肽均具备强免疫原性（图3C、D）；对比分析可见，PCs激活T细胞的能力显著优于野生型肽，而PNCs的免疫原性整体又显著高于PCs（图3E）。

图3. 新抗原鉴定和免疫原性验证。

03--免疫肽来源的新抗原疫苗可在皮下及原位 HCC 模型中诱导有效的抗肿瘤免疫

依据 ELISPOT 结果，从 PC、PNC 中各选取7条免疫原性最强的肽构建疫苗，将8‑10 aa 原始短肽改造为 17‑25 aa 长肽，降低短肽诱发免疫耐受风险。

在 C57BL/6 小鼠皮下、原位肝癌模型中设置多组疫苗【经典长肽（PC_L）、非经典长肽（PNC_L）、经典短肽（PC_S）、非经典短肽（PNC_S）、二代测序（NGS）筛选长肽（Mut_L），均配 poly(I:C) 佐剂】以及PBS空白组、单纯佐剂对照组评估疗效。皮下模型体内给药的结果显示，各疫苗组均可显著抑制肿瘤生长；PNC_S非经典短肽短期抑瘤效果优异，14天内有40% 小鼠肿瘤完全消退（图4A-C），但短肽疫苗易诱发免疫耐受，后续部分小鼠肿瘤再次增殖；长肽可规避免疫耐受，抗肿瘤作用更持久。此外 PC_L、PNC_L 疗效优于 Mut_L，证实经质谱免疫肽组学结合体外功能验证得到的肽段是肿瘤疫苗的优质靶点。

在免疫机制上，所有新抗原疫苗治疗组均可促进树突状细胞成熟，诱导效应记忆T细胞（TEM）和中央记忆T细胞（TCM）扩增，上调 CD8⁺ T 细胞活化标志物4‑1BB（图4D-I）；长肽组较短肽组可进一步强化 CD8⁺ T 细胞活化与肿瘤浸润，其中 PNC_L 单细胞水平激活效应更强。非经典肽免疫原性更高可能在于其胸腺呈递少，因此识别这些肽的 T 细胞不易受中枢免疫耐受的限制，免疫应答活性更强。

综上，结果证实质谱免疫肽组学筛选的长肽疫苗具备优异、安全的长效抗肿瘤能力。

图 4. 新抗原疫苗在皮下HCC模型中的抗肿瘤功效。

由于皮下肝癌模型难以模拟肝脏特异性肿瘤微环境，研究继续构建原位HCC模型进一步验证疫苗疗效（图5A）。分组给药方案与皮下模型保持一致，利用生物发光成像检测肿瘤生长。结果显示，空白组与仅佐剂组肿瘤持续发展，而全部新抗原疫苗组均可抑制肿瘤生长（图5B）。其中，长肽组（PC_L、PNC_L）抑瘤效果最强、持续最久，肿瘤负荷降幅显著优于Mut_L组（图5C）。流式细胞术分析表明，长肽组可诱导更多成熟树突状细胞，并大量生成记忆T细胞，长效免疫记忆应答优于短肽 (PC_S, PNC_S) 与 Mut_L 组（图5D-F）；肝脏病理切片进一步证实长肽组肿瘤体积显著缩小 (图5G)。免疫组化结果显示长肽组诱导瘤内CD8+ T细胞浸润程度最高（图5H、I）。

这些发现进一步验证质谱筛选长肽新抗原的优势，证明其在肝脏特异性微环境下仍可诱导高效细胞毒性免疫应答，抗肿瘤效果稳定可靠。

图5. 新抗原疫苗在原位HCC模型中的抗肿瘤功效。

04--PRM靶向质谱验证新抗原在皮下和原位HCC肿瘤中稳定表达

为全面评估这套新抗原发现工作流程在不同肿瘤微环境中的稳定性和可重复性，对皮下和原位两种 HCC 模型的免疫肽组进行了比较分析。结果显示，虽然两种模型的免疫肽组图谱存在较大差异，但大部分高排名新抗原候选肽在皮下和原位肿瘤中均能重复检出。

通过 PRM 靶向质谱验证，进一步确认了这些肽段的内源性表达。其中皮下肿瘤中验证了 4 条经典肽和 3 条非经典肽，原位肿瘤中验证了 4 条经典肽和 4 条非经典肽，高质量的 MS/MS 谱图为这些验证结果提供了坚实支撑（图6A）。此外，还对延伸后的长肽进行了内源性检测，成功在肿瘤组织中验证了 2 条经典长肽和 1 条非经典长肽（图6B），这证明了肽段延伸策略的可靠性.

这种跨肿瘤模型的高度重叠验证结果充分说明了基于免疫肽组学的新抗原鉴定流程具有良好的稳定性和可重复性，为其后续临床应用转化奠定了坚实基础。

图 6. 代表性新抗原的靶向PRM验证

  总结   

研究建立了一条从新抗原发现到功能验证的完整工作流程，实验结果表明，质谱筛选的新抗原疫苗可通过多重途径显著增强抗肿瘤免疫，包括激活树突状细胞、构建长效免疫记忆、刺激细胞毒性T细胞应答。其中长肽疫苗能够有效规避免疫耐受，诱导持久的肿瘤特异性免疫记忆，实现长期抑瘤；非经典肽免疫原性与治疗效果均优于经典肽，是极具潜力的新型免疫治疗靶点。

研究证明了基于质谱免疫肽组学结合从头测序技术能够系统发现肝细胞癌中来源多样、免疫原性更强的非经典新抗原，同时也为开发下一代个性化肝癌免疫治疗策略提供了坚实的理论基础和实验依据。

文献信息：
标题：Mass spectrometry-based de novo sequencing reveals non-canonical neoantigens with antitumor efficacy in hepatocellular carcinoma
期刊：Journal of Hepatology Reports
DOI：10.1016/j.jhepr.2026.101775

PEAKS^® DeepNovo Peptidome 工作流专为免疫肽组学而设计，整合了从头测序、数据库检索与同源搜索等多种鉴定方式，可完成免疫肽的全面分析，同时支持DDA与DIA数据的鉴定。

该工作流创新性地为多肽的 de novo 测序结果提供FDR评估，有效提升从头测序鉴定准确性；其内置深度学习模型经大规模HLA多肽数据集训练，可精准预测保留时间、碎片离子谱图及离子淌度，并覆盖标准PTM、同位素标签及TMT标记等修饰类型，确保各类修饰肽段的准确鉴定，从而实现对隐蔽抗原与新生抗原的深度挖掘。

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