方案摘要：牛出血性败血症是由多杀性巴氏杆菌引起的一种急性、热性、高度接触性畜禽传染病，对养牛业造成严重经济损失，快速、精准的病原检测与分型是该病防控的关键。本实验将Pipetty系列电动移液器应用于牛出血性败血症多重聚合酶链式反应（多重PCR）检测全过程，通过精准、稳定的移液操作，完成样本DNA模板制备、PCR反应体系配制、电泳上样等核心步骤。相较于传统手动移液器，Pipetty电动移液器可有效提升微量试剂、样本移液的精确度与重复性，降低人为操作误差，提高PCR检测结果的稳定性与可靠性，适用于临床牛出血性败血症快速检测、流行病学调查及病原分型研究。
 
方案详情：
一、实验原理
牛出血性败血症的致病菌为多杀性巴氏杆菌，不同荚膜型菌株的致病性、流行特征存在显著差异，其中A、B、D、E型为牛群主要流行血清型。多重PCR技术可在同一反应体系中加入多对特异性引物，同时扩增多个靶基因片段，实现单次反应完成病原鉴定与血清分型。
二、实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② PCR 扩增仪；
③ 高速微型离心机；
④ 稳压稳流电泳仪；
⑤ 水平电泳槽；
⑥ 凝胶成像仪。 
2、主要试剂
① PCR 试剂：TaqDNA 聚合酶、2.5 mmol/L 的 dNTPs 预混液、10×PCR 缓冲液；
② TAE 电泳缓冲液：50×TAE；
③ 溴酚蓝缓冲液（商品化试剂）。
④ 2% 琼脂糖凝胶。
⑤ DNA 分子质量标准（DNA Marker）。
⑥ 阳性对照质粒；
⑦ 引物序列按照表 2。
 
 
三、实验步骤
1、从平板上选择单个菌落，用灭菌接种环，接种至 200 μL 生理盐水中，煮沸 10 min，冰上冷却 3 min~ 5 min，12000 r/min 离心 30 s，取 2 µL 上清液作为 DNA 模板用于 PCR 扩增（约 0.1 µg/µL），或使用商品化的 DNA 提取试剂盒提取 DNA 作为模板 。 提取的基因组 DNA，应立即进行PCR 反应或置-20 ℃保存备用。
2、使用Pipetty电动移液器，配制 25 μL 反应体系，并将试剂提前预混，然后设置连续分液模式，快速加入到孔板中。
——2.5 μL的10×PCR Buffer；
——5 μL的dNTPs（2.5 mmol/L）；
——0.25μL的 TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）；
——1 μL的Pm荚膜 A型/B型/D 型/E型/F 型的分型特异性引物F（20 μmol/L）；
——1 μL的Pm 荚膜 A 型/B 型/D 型/E 型/F 型的分型特异性引物 R（20 μmol/L）；
——1 μL的KMT1T7（20 μmol/L）；
——1 μL的KMT1SP6（20 μmol/L）；
——100 ng的提取样本的 DNA 模板；
——补足双蒸水至 25 μL。
 
3、加样完成后，4 000 r/min 离心 20 s 后，置 PCR 扩增仪内进行扩增。
4、进行巴氏杆菌种属鉴定时，阳性对照以携带巴氏杆菌属鉴定靶基因质粒作为模板；进行分型鉴定时，分别以携带 5 种多杀性巴氏杆菌靶基因质粒作为模板。阴性对照均为不含 DNA 的反应体系。
5、PCR 反应程序。94 ℃ 3 min 预变性；94 ℃变性 30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，进行35 个循环的扩增；72 ℃再延伸 10 min，4 ℃保存。在退火温度不改变的情况下，也可根据商品化的PCR 扩增试剂盒中建议的反应程序进行扩增。
6、使用Pipetty电动移液器，吸取10 μLPCR产物与适量溴酚蓝缓冲液，自动混匀，再加样2% 琼脂糖凝胶，连续分液模式，等量加入7 μL/孔，同时，设定 2 kb DNA ladder 标准分子质量标准，120 V 稳压电泳 40 min。置于凝胶成像仪上，观察条带。
 
 
 
四、试验成立条件
阳性对照出现约 457 bp 扩增条带且阴性对照不出现条带，试验成立。
 
五、结果判定
1、出现 457 bp 左右的目的片段（与阳性对照大小相符），判为多杀性巴氏杆菌核酸阳性；未出现目的片段，判为多杀性巴氏杆菌核酸阴性。
2、同时出现约 457 bp、564 bp 共 2 条扩增条带，判为荚膜 A 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性。
3、同时出现约 457 bp、760 bp 共 2 条扩增条带，判为荚膜 B 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性。
4、同时出现约 457 bp、657 bp 共 2 条扩增条带，判为荚膜 D 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性。
5、同时出现约 457 bp、511 bp 共 2 条扩增条带，判为荚膜 E 型多杀性巴氏杆菌核酸阳性。