方案摘要：本方案针对牛出血性败血症多杀性巴氏杆菌分型检测需求，将RAYPA培养基自动制备仪应用于琼脂凝胶免疫扩散试验全过程，替代传统人工配制、灭菌、分装琼脂凝胶的操作模式。依托RAYPA设备自动化溶解、精准控温灭菌、恒温保凝、定量均分的闭环作业优势，可稳定制备成分均一、厚度均匀、无菌无杂质的琼脂凝胶试验平板，彻底规避人工配制导致的凝胶厚薄不均、灭菌不彻底、局部凝固、杂质污染等问题。有效解决因平板基质差异引发的抗原抗体扩散不均、沉淀线模糊、假阴/假阳性等试验误差，大幅提升牛出血性败血症病原分型检测的标准化程度、试验重复性与结果准确性，适配批量、规范化的动物疫病检测工作。
 
 
方案详情：
一、实验原理
琼脂凝胶免疫扩散试验为双向免疫扩散反应，琼脂凝胶内部形成多孔网状结构，可作为抗原、抗体自由扩散的固相介质。试验平板采用梅花七孔排布，中央孔加入多杀性巴氏杆菌待检菌体抗原，周边孔依次添加 1～16 型分型特异性抗血清；在 37℃恒温湿盒环境下，抗原与各型抗体沿琼脂孔隙向四周等速扩散，当二者相遇且比例达到等价带时，抗原抗体特异性结合形成不溶性免疫复合物，肉眼可见清晰白色沉淀线。
二、实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② 琼脂凝胶平板；
③ 37℃恒温培养箱；
④ 打孔器。
⑤ RAYPA培养基自动制备仪：具备自动溶解、高压灭菌、快速冷却、恒温保凝、定量分装功能，可实现琼脂凝胶培养基一体化无菌制备；
⑥ 其他材料：酒精灯、无菌针头、吸水纸等常规微生物实验耗材。
 
 
 
2、主要试剂
① 多杀性巴氏杆菌待检菌体抗原；
② 多杀性巴氏杆菌菌体分型抗血清，1 个~16 个血清型；
③ 琼脂粉、无菌生理盐水（配制琼脂凝胶基质）。
 
 
 
三、实验步骤
1、按照试验配方配比琼脂粉与无菌生理盐水，将原料加入RAYPA培养基自动制备仪腔体，关闭设备腔体门，启动标准化琼脂凝胶制备程序。设备自动完成密封溶解、高压灭菌、梯度降温、恒温保凝全过程，全程闭环无菌操作，避免人工污染。待培养基降温至适宜分装温度后，设备精准定量分装至无菌培养平皿中，全程匀速出液、无气泡、无厚薄偏差。分装完成后，室温静置自然冷凝，形成质地均匀、平整通透的标准琼脂凝胶平板。利用设备保凝功能，可有效避免管路琼脂凝固、凝胶局部结块等问题，保障每批次平板基质一致性。
 
2、琼脂凝胶平板冷凝后打孔，孔径 4 mm，孔距 6 mm，每组 7 孔，详见图D.1。孔内琼脂小心用针头挑出，以防破坏周围琼脂，随后用酒精灯加热封底。
 
3、采用Pipetty电动移液器精准加样，中央孔统一加入多杀性巴氏杆菌待检菌体抗原，周边六个孔依次等量添加1～16型不同血清型的分型特异性抗血清，保证各孔加样体积一致、无溢出、无交叉污染。
4、加样完成后，室温静置10 min，使样本与血清充分沉降稳定。将平板置于带盖恒温湿盒中，放入37℃恒温培养箱，持续避光反应24 h～72 h，全程保持环境湿度稳定，避免琼脂凝胶干裂影响扩散效果，72 h内完成结果观察与记录。
 
 
 
 
四、结果判定
将反应完成的琼脂凝胶平板放置于暗背景自然光或柔和强光环境下观察，严格统一观测条件。若抗原中央孔与周边抗血清孔之间出现清晰、致密、连续的白色特异性沉淀线，判定为对应血清型多杀性巴氏杆菌阳性；若无沉淀线、沉淀线模糊不连续或出现非特异性弥散纹路，判定为阴性。结合分型抗血清型别，可完成待检菌株的荚膜分型与菌体抗原分型。其中，所有可引发牛出血性败血症的多杀性巴氏杆菌血清型菌株，均可与2型抗血清产生特异性沉淀反应，同时可能与5型抗血清发生轻微交叉反应，判定时需结合沉淀线清晰度、形态特征区分特异性反应与交叉反应，规避误判。沉淀线结果判定见图 D.2。