方案摘要：本方案依托RT-PCR检测技术，开展犬瘟病毒（CDV）核酸检测实验，全程采用Pipetty系列电动移液器完成试剂分装、样本加样、溶液转移等精准移液操作。通过Trizol法提取样本总RNA，经反转录、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，结合阴阳性对照结果判定样本中犬瘟病毒核酸携带情况。Pipetty电动移液器可有效提升实验移液精度与重复性，降低人为操作误差，保障犬瘟病毒RT-PCR检测结果的准确性与可靠性，适用于犬瘟病毒的临床快速检测与样本筛查。
 
 
方案详情：
一、实验原理
犬瘟病毒（CDV）为RNA病毒，本实验基于反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）原理，先通过Trizol试剂提取待检样本中的病毒总RNA，再以RNA为模板，在反转录酶作用下合成cDNA，随后以cDNA为模板进行特异性PCR扩增。利用特异性引物扩增犬瘟病毒目的基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，根据特异性核酸条带的有无及片段大小，判定样本是否携带犬瘟病毒。
二、实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② 冰箱(4℃、-20℃、-70℃)；
③ PCR仪；
④ 高速冷冻离心机(4℃、离心速度12000r/min以上)；
⑤ 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；
⑥ 凝胶成像系统；
⑦ 无 RNA 酶离心管与带滤芯吸头。
 
2、主要试剂
① Trizol试剂：RNA 提取试剂，2℃~8℃保存，也可用商品化 RNA 提取试剂盒；
② 三氯甲烷；
③ 异丙醇；
④ DEPC水(0.1%)；
⑤ 75%(体积分数)乙醇；
⑥ RT-PCR相关试剂；
⑦ 10×RT-PCRBuffer；
⑧ RTEnzymeMix；
⑨ 5×TBE电泳缓冲液。
 
三、实验步骤
1、取1.5mL无 RNA 酶离心管，按照样本数量编号，使用Pipetty电动移液器，每管加入750μL Trizol试剂后，再使用连续分液模式，分别加入处理好的待检样品上清液、CDV 阴性对照及 CDV 阳性对照 250μL，混匀模式，充分吹打20次~30次，4℃ 12000r/min离心10min。
2、使用Pipetty，取500μL上清液至新的1.5mL无 RNA 酶离心管中，连续分液模式，每管加入150μL三氯甲烷，于混匀器上混匀15s，4℃ 12000r/min离心15min。
 
3、取上清液至新的1.5 mL 无 RNA 酶离心管中，每管加入500μL 异丙醇，颠倒数次混合均匀，冰上静置10min，4℃ 12000r/min离心10min。
4、小心弃掉上清液，倒置在干净的吸水纸上晾干水分，沉淀用1mLDEPC水配制的75%(体积分数)乙醇清洗；4℃ 8000r/min离心10min。
5、小心弃掉上清液，倒置在干净的吸水纸上室温自然干燥10min，加入20μLDEPC 水溶解RNA 沉淀。
6、置于冰上备用，并于2h内进行 RT-PCR扩增，超过2h应置于-70℃冰箱中保存。
7、可使用等效的商品化试剂盒进行 RNA 提取。
8、使用Pipetty电动移液器，预先配置好RT-PCR反应体系，再使用连续分液模式，批量转移至96孔板或PCR管中。
 
9、将 PCR 管置 PCR 仪上按如下程序扩增：42℃ 反转录 30 min；94℃ 预变性 2 min；94℃变性30s，55 ℃退火30s，72℃延伸40s，进行35个循环；最后72℃延伸3min。
10、用 TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶平板，将凝胶平板放入水平电泳槽中，使电泳缓冲液刚好没过胶面，将10μLPCR 产物和2μL 加样缓冲液(6×)混匀后缓慢加入样品孔中。电泳时应设立DNA 标准分子量对照。在120V、90 mA 条件下电泳约30 min，电泳结束后，用凝胶成像系统观察结果。
 
 
 
四、结果判定
1、 CDV 阳性对照样品扩增出大小为455bp的核酸片段，且阴性对照样品无扩增条带，则阴、阳性对照成立；否则试验结果无效，电泳图如下。
 
2、 在阴、阳性对照成立条件下，若待检样品扩增出大小为455bp的核酸片段，判为 CDV核酸阳性；若待检样品无扩增条带或扩增条带大小不为455bp，判为 CDV 核酸阴性。