方案摘要：本实验以 Pipetty 电动移液器为核心精准移液设备，依托其高精度定量移液、连续分液、自动混匀、恒温精度补偿的智能化优势，标准化完成血清梯度稀释、试剂等量加样、体系混匀等关键操作，通过抗原抗体特异性凝集反应实现待检菌株的鉴定与荚膜分型，有效规避人工操作误差，大幅提升实验准确性、一致性与实操效率，为牛出血性败血症快速血清学诊断与病原分型提供标准化技术方案。
方案详情：
一、实验原理
间接血凝试验是以绵羊红细胞为载体的特异性免疫血清学反应，核心原理为抗原抗体的特异性可逆结合。将多杀性巴氏杆菌荚膜抗原吸附于新鲜绵羊红细胞表面，制备致敏绵羊红细胞，使其成为携带特异性抗原的载体颗粒；当体系中加入对应的荚膜型特异性抗血清时，血清中的特异性抗体可与致敏红细胞表面的荚膜抗原发生特异性结合，使红细胞之间发生交联、聚集，形成肉眼可见的凝集现象，即为阳性反应。若无对应抗体或抗原，红细胞无交联反应，会自然沉降于孔底形成纽扣状沉淀，为阴性反应。
二、实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
① Pipetty电动移液器；
② 血凝反应板；
③ 无菌离心管；
④ 样本试剂槽；。
 
2、主要试剂
① 阿氏液（Alsever’s 液）；
② 0.85% NaCl 溶液；
③ 标准菌及待检菌荚膜抗原；
④ 荚膜型特异性抗血清；
⑤ 1% 新鲜绵羊红细胞；
⑥ 1% 致敏绵羊红细胞。
 
 
三、实验步骤
1、使用Pipetty电动移液器，在反应板每排第1孔加入0.85%NaC1溶液0.72mL，切换连续分液模式，自第2孔起各孔分别加入0.85%NaC1溶液0.4mL。
 
2、各荚膜型特异性抗血清各自单独一排稀释，第1孔加入血清0.08mL，自动混匀模式，匀速混匀，单次吸液模式下，吸取0.4 mL至下一孔，自动混匀，同样方法稀释至第7孔，按图1所示。
 
3、使用Pipetty连续加样功能，每孔加入 0.4 mL 1% 致敏绵羊红细胞。
4、同时设如下对照：
——血清对照：血清（10 倍稀释）0.4 mL+1% 新鲜绵羊红细胞 0.4 mL；
——绵羊红细胞对照：1% 新鲜绵羊红细胞 0.4 mL+ 0.85% NaCl 溶液 0.4 mL；
——抗原对照：1% 致敏绵羊红细胞 0.4 mL+ 0.85% NaCl 溶液 0.4 mL。
5、加样后，轻微振荡，置（24±1）℃，于 2 h~l8 h 内判读并记录结果。
 
四、结果判定
绵羊红细胞沿着凹孔坡面呈絮块状凝集为巴氏杆菌阳性在孔中央形成纽扣状为巴氏杆菌阴性。
根据抗血清的种类，可鉴定待检菌的荚膜型。依据凝集范围的大小判定凝集程度为以下几级：
a） “++++”凝集颗粒细密并均匀地分布在整个孔底，示 100% 凝集，判为强阳性；
b） “+++”凝集的红细胞平铺孔底，但有卷边或缺口，示 75% 凝集，判为阳性；
c） “++”红细胞呈薄层凝集，面积小，示 50% 凝集，判为弱阳性；
d） “+”红细胞不完全沉于孔底，周围有散在少量凝集，示 25% 凝集，判为阴性；
e）“-”红细胞沉积在孔中央，如小圆盘或纽扣状，示无凝集，判为阴性。