方案摘要：借助 RAYPA 培养基自动制备分装仪完成检测所需各类培养基/缓冲液的制备与分装，替代传统手动操作，实现“称量-溶解-灭菌-分装-冷却”全流程自动化控制，保障无菌性与定量一致性。本方案以“样品处理-梯度稀释-三级发酵-结果判定”为核心逻辑，融入RAYPA培养基自动制备分装仪优势优化检测流程。前期依托仪器实现全自动化制备分装，后续样品处理以 RAYPA 预制液为基质，确保 1:10 及系列稀释精准；初发酵、复发酵、确认试验依托标准化培养基，保障产气观察、菌落识别准确。最终结合 MPN 检索表报告结果，因仪器保障各环节精准无菌，检测重复性与准确性显著提升，适配多批次检测需求。
 
方案详情：
一、实验原理
       大肠埃希氏菌 MPN 计数法，核心是基于概率统计的数量估算方法。其原理为：先对样品做 10 倍梯度稀释，选取连续稀释度各接种多支选择性培养管；经培养后，依据大肠埃希氏菌分解乳糖产酸产气的特性判断阳性管；最后根据各稀释度阳性管分布组合，结合泊松分布原理，查阅 MPN 表推算出样品中该菌的最可能数量。
二、‌实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
① RAYPA培养基自动制备分装仪;
② Pipetty Pro 非等量电动移液器:MSIC12-01-1000;
③ 恒温培养箱:36 ℃±1℃;
④ 冰箱:2 ℃~8 ℃;
⑤ 恒温水浴箱:44.5 ℃±0.2 ℃;
⑥ 恒温装置:48 ℃±2℃;
⑦ 天平:感量 0.1g;
⑧ 均质器及无菌均质袋、均质杯,振荡器;
⑨ 试管:15 mmX150 mm、18 mmX180 mm 、以及小倒管(杜氏管）;
 ⑩ 无菌锥形瓶:容量 500 mL;
⑪ 无菌培养皿:直径 90 mm;
⑫ pH 计或精密 pH 试纸;
⑬ 无菌接种环:10 μL。
 
2、试剂和材料
① 磷酸盐缓冲液;
② 生理盐水;
③ 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤;
④ EC 肉汤;
⑤ 胰蛋白胨胆盐 X-葡萄糖醛酸苷(TBX)琼脂;
⑥ 1 mol/I NaOH;
⑦ 1 mol/L HCl。
 
三、实验步骤
1、实验前准备
① 通过 RAYPA 仪器自动完成磷酸盐缓冲液、生理盐水的制备与定量分装（精准设定 225mL /份、9mL/份规格），仪器内置无菌程序，避免手动分装污染，同时为后续样品稀释提供精准基质。
 
② RAYPA 自动完成原料称量、高温灭菌后，将LST 肉汤及EC 肉汤精准分装至无菌试管，分装过程全程密闭，避免杂菌污染，且每管培养基液面高度一致，保障产气观察准确性。​
③ RAYPA自动完成琼脂溶解、温度调控后，定量分装至无菌培养皿内，避免手动倾倒导致的厚度不均问题，保障后续菌落观察清晰度。
 
2、样品处理与梯度稀释
① 固体和半固体样品:无菌操作称取 25g样品,放入盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min~10 000 r/min 均质1 min~2 min;或放入盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1 min~2 min,制成 1:10 的样品匀液。
② 液体样品:用无菌吸管吸取 25 mL样品置于盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中充分混匀,或放入盛有 225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2 min,制成1:10的样品匀液。
③ 必要时用1 mol/L, NaOH 或1 mol/L HC1,调节样品匀液或液体样品原液的 pH 至 6.5~7.5。
④ 用移液器吸取1:10 样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入装有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中,将试管在振荡器上振荡混匀,制成1:100的样品匀液。
 
⑤ 根据对样品污染状况的估计,依次制成 10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支无菌吸头。
3、初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液,每个稀释度接种3管LST肉汤,每管LST肉汤接种1mL样品匀液。从制备样品匀液开始至接种至LST肉汤完毕,全过程不得超过15 min。将已接种样品的 LST肉汤管置于 36 ℃±1 ℃培养 24 h±2h,检查产气情况。小倒管或产气收集装置内有气泡产生,或轻轻振摇LST肉汤管可见试管内有细密气泡不断上升者,判断为产气,产气者进行复发酵试验。如未产气则继续培养至 48 h±2h,产气者进行复发酵试验;培养至48 h+2h,仍未产气者判断为大肠埃希氏菌阴性。若培养至 48 h±2h,所有LST肉汤管均未产气,MPN 检索表,报告每克(毫升)样品中大肠埃希氏菌的 MPN值,以 MPN/g(mL)表示。 
4、复发酵试验
轻轻振摇各产气的LST肉汤管,分别用接种环取培养物1环,转种至EC肉汤管中,放入带盖的水浴箱内。水浴箱的水面至少高于 EC肉汤培养基液面1cm~2cm,44.5 ℃±0.2 ℃培养 24 h±2h,检查产气情况,如未见产气则继续培养至 48 h±2 h。记录 48 h±2h内所有产气的 EC肉汤管数,并进行确认试验。若培养至 48 h±2 h,所有 EC肉汤管均未产气,判断为大肠埃希氏菌阴性,按照MPN 检索表,报告每克(亳升)样品中大肠埃希氏菌的 MPN 值,以 MPN/g(mL)表示。
5、确认试验
轻轻振摇各产气的 EC肉汤管,分别用接种环取培养物划线接种于 TBX琼脂平板,36 ℃±1℃培养 18 h~24 h,观察 TBX琼脂平板上的菌落,大肠埃希氏菌在 TBX 琼脂平板上的菌落为蓝绿色。TBX琼脂平板上有蓝绿色菌落者,其对应的EC肉汤产气管为大肠埃希氏菌阳性,否则为阴性。
 
四、结果报告
依据3个适宜的连续稀释度中大肠埃希氏菌的阳性管数,按照MPN 检索表。报告每克(毫升)样品中大肠埃希氏菌的 MPN 值,以 MPN/g(mL)表示。