方案摘要：本方案基于大肠菌群计数标准原理，整合 Pipetty 电动移液器与自动菌落计数仪的核心优势，优化实验全流程。样品稀释环节，借助 Pipetty 的精准定量与连续稀释功能，高效制备 10 倍递增系列稀释液，避免手动操作误差；接种时通过其定量接种功能，确保每皿 1mL 接种量精准一致。培养后采用自动菌落计数仪，预设菌落识别参数，快速筛选有效平板、区分典型与可疑菌落，计数效率较人工大幅提升提升，且支持数据与图像存储追溯。确认试验中，依托仪器菌落定位功能精准挑取目标菌落验证。方案大幅提升实验精准性、效率性与规范性，缩短验周期，适用于各类样品的大肠菌群检测，保障数据可靠可追溯。
 
方案详情：
一、实验原理
       以 VRBA 培养基为核心，利用胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性菌，仅允许大肠菌群等革兰氏阴性菌生长。大肠菌群发酵培养基中乳糖产酸，使中性红指示剂变红，形成红色至紫红色典型菌落（部分带沉淀环），实现特异性识别。通过10倍递增稀释样品，让平板菌落数落在 15-150 CFU 的可计数范围，再挑取典型/可疑菌落接种 BGLB 肉汤，观察发酵产气情况排除假阳性，最终定量样品中大肠菌群数量。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
① Pipetty 电动移液器；
② 冰箱:2 ℃~8 ℃；
③ 恒温装置:48 ℃±2℃；
④ 天平:感量 0.1 g；
⑤ 均质器及无菌均质袋、均质杯,振荡器；
⑥ 试管:15 mmX150 mm、18 mmX180 mm ；
⑦ 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃、30 ℃±1℃；
⑧ 无菌锥形瓶:容量 500 mL；
⑨ 无菌培养皿:直径 90 mm；
⑩ pH 计或精密 pH 试纸；
⑪ 无菌接种环:10μL(直径约3mm)；
⑫ SHASHIN KAGAKU自动菌落计数仪。
 
2、试剂和材料
① 磷酸盐缓冲液；
② 生理盐水；
③ 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤；
④ 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤；
⑤ 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)；
⑥ 1 mol/L NaOH；
⑦ 1 mol/L HCl；
 
三、实验步骤
1、稀释样品
① 固体和半固体样品:无菌操作称取 25g样品,放入盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min~10000 r/min 均质1 min~2 min。
② 液体样品:用无菌吸管吸取 25 mL样品置于盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中充分混匀。
③ 必要时用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HC1调节样品匀液或液体样品原液的 pH 至 6.5~7.5之间。
④ 使用 Pipetty 电动移液器，装配无菌吸头，吸取1:10样品匀液 1mL，沿无菌试管管壁缓缓注入预装有9mL缓冲液/生理盐水的无菌试管中（吸头尖端不触及稀释液面）。试管置于振荡器上振荡混匀，制成1:100匀液；按样品污染状况估计，重复上述操作，依次制备10倍递增系列稀释液，每递增稀释1次，更换1个无菌吸头。
 
2、根据样品污染状况估计，选取2-3个连续适宜稀释度（液体样品可含原液），每个稀释度设置2个无菌培养皿。使用 Pipetty 电动移液器更换新无菌吸头，精准吸取1mL对应稀释度的样品匀液，垂直注入培养皿中央，同时设2个空白对照，每皿注入1mL缓冲液/生理盐水。
3、尽快向培养皿倒入 48℃±2℃的VRBA培养基，每皿15-20mL，轻轻旋转培养皿使培养基与样品匀液充分混匀，水平静置待其凝固。凝固后，均匀覆盖3-4mL VRBA至平板表面，覆层凝固后翻转平板。
4、将平板放入自动菌落计数仪内，预设颜色阈值：红色-紫红色直径阈值：0.5mm，自动扫描平板。仪器自动计测菌落数量，并精确转换成CFU，筛选菌落数在15-150 CFU 之间的有效平板，同时区分典型菌落（红色至紫红色、直径≥0.5mm、周围带红色沉淀环）与可疑菌落（红色至紫红色、直径≤0.5mm），分别统计数量并生成计数报告。
 
5、确认试验
① 基于自动菌落计数仪的计数结果，精准挑取目标菌落进行验证，确保大肠菌群阳性结果的准确性。
② 从同一稀释度的 VRBA 平板上，精准挑取典型和可疑菌落各 5 个；若典型或可疑菌落少于 5 个，则挑取全部菌落。
③ 每个挑取的菌落接种1支BGLB肉汤管，置于36℃±1℃培养24h±2h。
④ 培养 24h±2h 后，观察并记录产气情况，产气者为大肠菌群阳性；未产气者继续培养至 48h±2h，若产气仍判定为阳性，未产气则为阴性。
 
四、结果报告
1、所选稀释度的典型菌落数以及可疑菌落数与各自大肠菌群阳性率的乘积之和的平均值,乘以稀释倍数,为大肠菌群的菌落数。大肠菌群的菌落数小于 100 CFU时,按“四舍五入”的原则修约,以整数报告。大肠菌群的菌落数大于或等于 100 CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数；也可用 10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,保留两位有效数字。若空白对照上有菌落生长,则此次检验结果无效。
2、称重取样以 CFU/g为单位报告结果,体积取样以 CFU/mL,为单位报告结果。