方案摘要：本方案基于MPN法原理开展克罗诺杆菌定量检验，核心引入RAYPA培养基自动制备分装仪优化流程。该仪器以一体化灭菌、精准控温及定量分装优势，制备厚度均一的显色培养基平板，降低污染风险与人为误差。实验通过BPW前增菌、mLST-Vm选择性增菌后，用仪器制备的显色培养基分离可疑菌落，经TSA纯化及生化鉴定确证。依据阳性管数查MPN检索表，报告100g(mL)样品MPN值。RAYPA仪器实现培养基制备标准化，较传统方式效率大大提升，同时提升无菌性与均一性，为检验结果精准性提供核心保障。
 
方案详情：

• 实验原理

克罗诺杆菌定量检验基于 MPN（最大可能数）法原理，结合选择性增菌、特异性分离及精准鉴定实现定量。先以 BPW 培养基前增菌，为少量目标菌提供生长环境；再用 mLST-Vm 选择性培养基抑制杂菌、富集目标菌。借助显色培养基分离可疑菌落，挑取后经 TSA 纯化，通过生化反应验证典型特征，可选 PCR 靶向 ITS 区域确认。最终依据不同稀释度阳性管数查 MPN 检索表，报告 100g (mL) 样品中目标菌 MPN 值。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
① Pipetty 电动移液器；
② 恒温培养箱:36 ℃士1 ℃,41.5 ℃±1℃；
③ 冰箱:2 ℃~5 ℃,-20 ℃；
④ 恒温水浴箱:41.5 ℃±1℃；
⑤ 天平:感量 0.1g、0.01g；
⑥ 振荡器；
⑦ 无菌容器:容量 100mL、200mL、2000 mL；
⑧ 无菌培养皿:直径90mm；
⑨ pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸；
⑩ 微生物生化鉴定系统；
⑪ PCR仪；
⑫ 离心机:转速≥12000r/min；
⑬ 凝胶成像系统或紫外检测仪；
⑭ 琼脂糖水平电泳仪或毛细管电泳仪；
⑮ PCR反应管；
⑯ RAYPA培养基自动制备分装仪；
 
2、试剂和材料
① 缓冲蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)；
② 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium,mLST-Vm)；
③ 克罗诺杆菌显色培养基；
④ 胰蛋白胨大豆琼脂(trypticase soy agar,TSA)；
⑤ 生化鉴定试剂盒；
⑥ 氧化酶试剂；
⑦ L-赖氨酸脱羧酶培养基；
⑧ L-鸟氨酸脱羧酶培养基；
⑨ L-精氨酸双水解酶培养基；
⑩ 糖类发酵培养基；
⑪ 西蒙氏柠檬酸盐培养基；
⑫ 克罗诺杆菌质控菌株；
⑬ 大肠埃希氏菌质控菌株；
 
三、实验步骤
1、取检样100g(mL)、10g(mL)、1g(mL)各3份，分别置于2000mL、200mL、100mL无菌容器中，对应加入900mL、90mL、9mL已通过恒温水浴箱预热至41℃±1℃的BPW培养基。将容器置于振荡器上轻柔振荡5~10min，确保检样充分溶解并与培养基混匀，制成1:10样品匀液。将上述匀液置于36℃±1℃恒温培养箱中培养18h±2h，完成前增菌。前增菌结束后，轻柔摇动容器使培养物混匀，用无菌1mL移液管精准吸取1mL前增菌液，转入含10mL mLST-Vm肉汤的无菌容器中，每个稀释度做3个平行管。将所有接种后的mLST-Vm肉汤容器置于41.5℃±1℃恒温培养箱中培养24h±2h，完成选择性增菌。
 
2、分离培养
① 提前启动RAYPA培养基自动制备分装仪，按照克罗诺杆菌显色培养基配方加入干粉培养基与适量无菌水，仪器自动完成加热融化及灭菌。待培养基灭菌后，仪器自动冷却至45℃以下并精准分装至无菌培养皿中，分装完成后自然凝固备用。此过程全程密闭操作，有效减少人工干预导致的污染风险，且每皿培养基体积、厚度均一，保障后续菌落生长的一致性。混匀mLST-Vm肉汤培养物，用Pipetty电动移液器精准吸取10μL培养物，分别在2个提前制备好的克罗诺杆菌显色培养基平板上进行划线接种。接种完成后，将平板倒置放入36℃±1℃恒温培养箱中培养24h±2h。
 
② 菌落纯化：根据克罗诺杆菌显色培养基的判定标准（如特定颜色、形态菌落）挑取可疑菌落，每个平板至少挑取5个（若不足5个则全部挑取）。使用无菌接种环挑取可疑菌落，分别划线接种于TSA平板上，置于36℃±1℃恒温培养箱中培养24h±2h，获得纯化菌落备用。
3、选取TSA平板上纯化后的菌落进行生化鉴定，优先选取克罗诺杆菌显色培养基上最具典型特征菌落对应的纯化菌落。用无菌接种环挑取新鲜传代的纯化菌落，按照微生物生化鉴定试剂盒说明书及关键生化指标检测要求，依次进行氧化酶试验、脱羧酶试验、糖类发酵试验及西蒙氏柠檬酸盐试验等。若首个典型菌落生化鉴定为阳性，则可判定该样品检出克罗诺杆菌，无需进一步鉴定其他菌落；若首个菌落为阴性，则依次选取其他纯化菌落进行鉴定，直至所有挑取菌落均为阴性（判定未检出）或出现阳性菌落（判定检出）。对于需精准溯源的场景，可选取阳性菌落进行PCR靶向ITS区域检测，进一步确认菌株身份。克罗诺杆菌的主要生化特征见表3。
 
四、结果报告
综合克罗诺杆菌显色培养基上的菌落特征及生化确证试验结果，统计各稀释度对应的mLST-Vm选择性增菌阳性管数。根据阳性管数查阅MPN检索表，计算并报告100g(mL)样品中克罗诺杆菌的MPN值。若所有稀释度均未检出阳性管，报告为“克罗诺杆菌未检出”。