方案摘要：本方案基于大肠菌群平板计数法，结合 Pipetty 电动移液器与SHASHIN KAGAKU自动菌落计数仪核心优势优化检测流程。样品稀释与接种阶段，Pipetty 凭借精准定量、防交叉污染及高效移液特性，确保接种量一致性，缩短样品处理时间，保障稀释梯度准确性。培养后，自动菌落计数仪通过预设颜色、直径阈值，快速批量扫描 VRBA 平板，自动筛选 15~150CFU 有效平板，精准区分典型与可疑菌落，避免人工主观误差，实现数据自动记录与追溯。提升检测效率、精准度与标准化水平，高效完成大肠菌群定量分析，为样品卫生状况评估提供可靠支撑。
 
方案详情：
一、实验原理
      以 VRBA 培养基为核心，通过胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性杂菌，利用大肠菌群发酵乳糖产酸使中性红指示剂变色，形成红色至紫红色特征菌落实现选择性分离。样品经梯度稀释后接种，在适宜温度下培养，挑取特征菌落接种 BGLB 肉汤，通过发酵产气确认阳性菌株，排除假阳性。最终选取 15~150 CFU 的有效平板，结合稀释倍数和接种体积计算样品中大肠菌群数量，评估样品卫生状况。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
① SHASHIN KAGAKU自动菌落计数仪;
② Pipetty 电动移液器MSIC01-03-1000;
③ 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃、30 ℃±1℃;
④ 冰箱:2 ℃~8 ℃;
⑤ 恒温装置:48 ℃±2 ℃;
⑥ 天平:感量 0.1 g;
⑦ 均质器及无菌均质袋、均质杯,振荡器;
⑧ 试管:15 mm×150 mm、18 mm×180 mm；
⑨ 无菌锥形瓶:容量 500mL;
⑩ 无菌培养皿:直径 90mm;
⑪ pH 计或精密 pH试纸;
⑫ 无菌接种环:10μL(直径约3mm);
⑬ RAYPA培养基制动制备分装仪。

2、试剂和材料
① 磷酸盐缓冲液；
② 生理盐水；
③ 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤；
④ 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤；
⑤ 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)；
⑥ 1 mol/L NaOH；
⑦ 1 mol/L HCl；
 
三、实验步骤
1、样品稀释
① 固体和半固体样品:无菌操作称取 25g样品,放入盛有 225 mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内,8000 r/min~10000 r/min 均质1 min~2 min，制成 1:10 的样品匀液。
② 液体样品:用无菌吸管吸取 25 mL样品置于盛有 225 mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中充分混匀,制成1:10 的样品匀液。
③ 必要时用1 mol/l NaOH 或1 mol/L HC1,调节样品匀液或液体样品原液的pH至 6.5~7.5之间。
④ 用Pipetty电动移液器吸取1mL的1:10 样品匀液，沿管壁缓缓注入装有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),将试管在振荡器上振荡混匀,制成1:100 的样品匀液。
 
⑤ 根据对样品污染状况的估计,参照上述稀释操作,依次制成 10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支无菌吸管或吸头。全程依托电动移液器的精准定量功能，避免手工吸液的误差。
2、接种与培养
① 根据对样品污染状况的估计,选取2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种2个无菌培养皿,每皿1mL。同时取磷酸盐缓冲液或生理盐水加入2个无菌培养皿作空白对照,每皿1mL。
② 将使用RAYPA培养基自动制备分装仪提前制备好的VRBA 自动分装至培养皿中,每皿 15 mL。小心旋转培养皿将培养基与接种的样品匀液充分混匀,水平静置待其凝固。从制备样品匀液开始至倾注 VRBA 完毕。全过程不得超过 15 min。琼脂凝固后,再均匀覆盖3 mL~4 mL VRBA 至整个平板表面。覆层的琼脂凝固后翻转平板,置于 36 ℃ ±1 ℃培养 18 h~24 h。对于乳及乳制品,应置于30 ℃±1 ℃培养 18h~24 h。
 
3、平板菌落数的选择
① 提前调试自动菌落计数仪，根据 VRBA 平板菌落特性，预设核心识别参数，颜色阈值红色至紫红色、直径阈值≥0.5mm 为典型菌落，＜0.5mm 为可疑菌落。
② 将培养后的所有 VRBA 平板批量放入自动菌落计数仪，仪器通过高清图像采集、智能识别技术，快速完成平板扫描。相比人工计数，可大幅缩短分析时间，实现100个培养皿/小时的高速精准计数，且避免肉眼疲劳导致的计数偏差。测量结果自动输出为EXCEL文档，并保存。
 
③ 若仪器识别到 2 个稀释度的平板菌落数 15~150CFU之间，或出现其他特殊菌落分布情形，按相关规则进行数据初步判定。从同一稀释度的 VRBA 平板上挑取典型和可疑菌落各5个,典型或可疑菌落少于5个者,则挑取其全部菌落。每个菌落接种1支 BGLB肉汤管,36℃±1℃培养 24h±2h,检查产气情况,产气者为大肠菌群阳性;未产气者则继续培养至48h±2h再观察,产气者为大肠菌群阳性,仍未产气者为大肠菌群阴性。
 
四、结果报告
1、所选稀释度的典型菌落数以及可疑菌落数与各自大肠菌群阳性率的乘积之和的平均值,乘以稀释倍数,为大肠菌群的菌落数。大肠菌群的菌落数小于100CFU 时,按“四舍五入”的原则修约,以整数报告。大肠菌群的菌落数大于或等于100CFU 时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,保留两位有效数字。
2、若空白对照上有菌落生长,则此次检验结果无效。
3、称重取样以 CFU/g为单位报告结果,体积取样以 CFU/mL为单位报告结果。