方案摘要：本方案以克罗诺杆菌 “富集 - 筛选 - 验证 - 确证” 为核心检验逻辑，深度融合 RAYPA 培养基自动制备分装仪优势，优化 BPW、LST-Vm 及显色培养基等关键培养基制备与分装流程。仪器通过自动溶解灭菌、定量分装的无菌闭环操作，解决人工制备的不均与污染问题。使实验效率得到有效提升，且程序固化参数消除个体差异。均一化培养基保障各环节检验稳定性，为克罗诺杆菌定性提供高效、标准化技术支撑。
 
 
方案详情：
一、实验原理
       克罗诺杆菌定性检验核心是 “富集 - 筛选 - 验证 - 确证” 的递进逻辑。先以 BPW 培养基前增菌富集目标菌，再用 LST-Vm 肉汤选择性增菌抑制杂菌、扩增目标菌。通过克罗诺杆菌显色培养基的特异性显色反应，筛选出可疑菌落。可选 PCR 鉴定利用特异性引物，靶向扩增目标菌 282bp 特征基因片段，实现分子层面快速验证。最终通过生化鉴定，依据克罗诺杆菌独特的代谢生化特征，排除假阳性，确证菌株身份，最终判定样品中是否存在该菌。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
① Pipetty 电动移液器；
② 恒温培养箱:36 ℃士1 ℃,41.5 ℃±1℃；
③ 冰箱:2 ℃~5 ℃,-20 ℃；
④ 恒温水浴箱:41.5 ℃±1℃；
⑤ 天平:感量 0.1g、0.01g；
⑥ 振荡器；
⑦ 无菌容器:容量 100mL、200mL、2000 mL；
⑧ 无菌培养皿:直径90mm；
⑨ pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸；
⑩ 微生物生化鉴定系统；
⑪ PCR仪；
⑫ 离心机:转速≥12000r/min；
⑬ 凝胶成像系统或紫外检测仪；
⑭ 琼脂糖水平电泳仪或毛细管电泳仪；
⑮ PCR反应管；
⑯ RAYPA培养基自动制备分装仪；
 
2、试剂和材料
① 缓冲蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)；
② 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium,mLST-Vm)；
③ 克罗诺杆菌显色培养基；
④ 胰蛋白胨大豆琼脂(trypticase soy agar,TSA)；
⑤ 生化鉴定试剂盒；
⑥ 氧化酶试剂；
⑦ L-赖氨酸脱羧酶培养基；
⑧ L-鸟氨酸脱羧酶培养基；
⑨ L-精氨酸双水解酶培养基；
⑩ 糖类发酵培养基；
⑪ 西蒙氏柠檬酸盐培养基；
⑫ 内转录间隔区(its)PCR引物；
⑬ 5U/μL 耐热 DNA 聚合酶。
⑭ 2.5mmol/dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP、25mmol/L MgCl₂；
⑮ 10×PCR 缓冲液、DNA 提取试剂、商品化 PCR 反应预混液；
⑯ 克罗诺杆菌质控菌株；
⑰ 大肠埃希氏菌质控菌株；
⑱ 核酸染色剂；
⑲ 分子质量标准:100 bp DNA ladder。
⑳ 50×TAE电泳缓冲液、6×DNA加样缓冲液。
 
三、实验步骤
1、培养基制备与增菌
① 按照BPW配方称取干粉试剂，加入指定量去离子水后，仪器启动自动搅拌溶解功能，同时实时监测并调节pH至7.2。经灭菌后，仪器自动将培养基预热至41℃±1℃，并无菌分装900mL至无菌容器中，全程避免人工操作引入的污染风险。
 
② 取100g（mL）检样加入上述BPW容器，摇匀后置于36℃±1℃培养箱中培养18h±2h，完成目标菌富集。相较于人工制备的BPW，RAYPA仪制备的培养基因成分均一，可确保不同样品的富集效率一致性，降低批次间误差。
③提前通过RAYPA制备LST-Vm肉汤，在灭菌后冷却至适宜温度时加入万古霉素，避免高温破坏药效。随后自动分装10mL至无菌试管中。用Pipetty电动移液器移取1mL前增菌液转入该试管，41.5℃±1℃培养24h±2h完成选择性增菌。仪器的精准分装使每支试管的营养浓度和抗生素含量完全一致，有效保证杂菌抑制效果的稳定性。
 
2、分离培养
① 通过RAYPA按照配方制备显色培养基，仪器的恒温保温模块将培养基稳定控制在45℃±1℃，并通过无菌分装功能向90mm培养皿中精准注入20mL培养基，确保培养基厚度均一。人工制备常出现的厚度不均、边缘凝固等问题被彻底解决，为菌落生长形态一致性提供基础。
 
② 混匀LST-Vm肉汤培养物，用Pipetty电动移液器吸取10μL，分别划线接种于2个上述显色培养基平板，36℃±1℃培养24h±2h。因培养基均一性提升，可疑菌落的显色反应更稳定，特征更清晰，便于后续挑取。
③ 按显色标准挑取可疑菌落（每平板至少5个，不足全挑），接种于RAYPA制备的TSA平板，36℃±1℃培养24h±2h备用。
3、PCR鉴定
① 从TSA平板挑取2-3个可疑菌落至500μL灭菌去离子水中，混匀后100℃加热10min，冰浴冷却，12000r/min离心10min，取上清作为DNA模板。由于RAYPA制备的TSA培养基营养均一，菌落生长状态稳定，可减少模板提取量的波动。
② 使用 Pipetty 电动移液器连续分液模式，按表 2 比例精准移取各组分，加入到PCR反应管中，使用电机代替人工操作，可有效避免人为误差，确保反应体系浓度均一，提升扩增重复性。
 
 
 
③ 设置反应条件，94℃预变性 5min；94℃变性 30s、61℃退火 30s、72℃延伸 30s（35 个循环）；72℃延伸 5min，4℃保存。
3、每次实验以克罗诺杆菌标准菌株为阳性对照，大肠埃希氏菌标准菌株为阴性对照，灭菌去离子水分别作为DNA提取空白对照和PCR反应体系空白对照，确保检测系统有效性。
4、制备1.5%琼脂糖凝胶，加入核酸染色剂，进行电泳，电压按电泳槽正负极距离×5V/cm设置，时间20-30min，通过凝胶成像系统观察结果。
5、质控系统正常，阴性及空白对照无扩增条带，阳性对照出现282bp条带时，待测样品出现282bp条带为阳性，无则为阴性。
6、从PCR阳性的TSA平板挑取菌落进行生化鉴定。RAYPA仪制备的标准化培养基培养的菌落代谢特征更典型，可提升生化鉴定的准确性，有效排除假阳性。
 
四、结果报告
综合显色培养基菌落特征、PCR鉴定结果及生化确证结果，报告100g（mL）样品中克罗诺杆菌的检出或未检出情况。