方案摘要：本方案围绕大肠埃希氏菌检测流程优化，深度融合 RAYPA 培养基自动制备分装仪核心优势，提升检测效率与准确性。培养基制备环节，仪器可实现自动加热溶解、48℃±2℃精准控温及 15-20mL / 皿定量分装，避免人工操作导致的浓度不均、温度波动等问题。仪器保障培养基均一性，让蓝绿色典型菌落更易识别，结合规范计数规则，显著提升结果重复性。整体方案通过自动化升级，简化操作步骤、减少人为误差，为大肠埃希氏菌检测提供高效可靠的解决方案。
 
 
方案详情：
一、实验原理
       通过梯度稀释样品，降低菌液浓度以避免菌落重叠，再将稀释液接种至选择性培养基。该培养基可抑制杂菌生长，仅允许大肠埃希氏菌繁殖，培养后单个或一群大肠埃希氏菌形成可见菌落。通过计数符合特征的菌落，结合菌落形成单位（CFU）换算样品中该菌浓度，同时借助生化反应确认菌种，确保计数结果准确。
二、‌实验准备
1、设配和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
① RAYPA培养基自动制备分装仪;
② Pipetty Pro 非等量电动移液器:MSIC12-01-1000;
③ 恒温培养箱:36 ℃±1℃;
④ 冰箱:2 ℃~8 ℃;
⑤ 恒温水浴箱:44.5 ℃±0.2 ℃;
⑥ 恒温装置:48 ℃±2℃;
⑦ 天平:感量 0.1g;
⑧ 均质器及无菌均质袋、均质杯,振荡器;
⑨ 试管:15 mmX150 mm、18 mmX180 mm 、以及小倒管(杜氏管）;
 ⑩ 无菌锥形瓶:容量 500 mL;
⑪ 无菌培养皿:直径 90 mm;
⑫ pH 计或精密 pH 试纸;
 ⑬ 无菌接种环:10 μL。
 
2、试剂和材料
① 磷酸盐缓冲液;
② 生理盐水;
③ 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤;
④ EC 肉汤;
⑤ 胰蛋白胨胆盐 X-葡萄糖醛酸苷(TBX)琼脂;
⑥ 1 mol/I NaOH;
⑦ 1 mol/L HCl。
 
三、实验步骤
1、样品的稀释
① 固体和半固体样品:无菌操作称取 25g样品,放入盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min~10 000 r/min 均质1 min~2 min;或放入盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1 min~2 min,制成 1:10 的样品匀液。
② 液体样品:用无菌吸管吸取 25 mL样品置于盛有 225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶中充分混匀,或放入盛有 225ml,磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2 min,制成1:10的样品匀液。
③ 必要时用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HC1,调节样品匀液或液体样品原液的 pH 至 6.5~7.5。
④ 用Pipetty电动移液器吸取1:10 样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入装有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中,将试管在振荡器上振荡混匀,制成1:100的样品匀液。
 
⑤ 根据对样品污染状况的估计,依次制成 10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支无菌吸头。
2、样品接种准备
根据对样品污染状况的估计，选取2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液。使用Pipetty电动移液器，向每个选定稀释度对应的2个无菌培养皿中各接种1mL样品匀液。同时，取磷酸盐缓冲液或生理盐水1mL加入2个无菌培养皿作为空白对照。
3、培养基制备与倾注培养
① 培养基制备：将TBX琼脂干粉与定量无菌水按配方比例加入RAYPA培养基自动制备分装仪内，通过仪器触控屏设定制备参数。仪器可实现培养基的自动加热溶解、精准控温搅拌，确保琼脂完全溶解且浓度均匀，避免人工制备时因加热不均导致的培养基质量波动。
 
② 温度精准控制：仪器内置高精度温控系统，可将制备完成的TBX琼脂自动恒温至48℃±2℃的最佳倾注温度，无需人工反复测温调整，彻底解决传统水浴控温效率低、温度波动大的问题。
③ 自动分装倾注：在接种完成后，通过仪器触控屏设定分装体积（15mL~20mL/皿），启动自动分装程序。仪器的精准分装泵保证各培养皿中培养基厚度一致，为菌落生长提供均一环境，并避免人工接触造成的污染。
 
④ 混匀与凝固：将培养皿进行轻柔旋转混匀，确保培养基与接种的样品匀液充分接触且无气泡产生；随后将培养皿水平静置，待其凝固。
⑤ 培养衔接：琼脂凝固后，将平板翻转，置于36℃±1℃的恒温培养箱中培养18h~24h。若采用RAYPA仪器配套的一体化培养模块，可直接通过仪器设定培养参数，实现从分装到培养的无缝衔接，进一步提升操作效率。
4、平板菌落数的选择
TBX琼脂平板上大肠埃希氏菌的典型菌落为蓝绿色,选择典型菌落数在 15 CFU~150 CFU 之间的平板,对典型菌落进行计数。
5、大肠埃希氏菌菌落数的计算
① 若只有1个稀释度的平板上典型菌落数在计数范围内,以该稀释度典型菌落数的平均值,再乘以相应稀释倍数进行结果计算。
② 若有两个连续稀释度的平板上典型菌落数在计数范围内时,结果按式(1)计算:
 
③ 若所有稀释度的平板上典型菌落数均大于 150 CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他稀释度的平板菌落数可记录为多不可计,结果按最高稀释度典型菌落数的平均值乘以相应稀释倍数计算。
④ 若所有稀释度的平板上典型菌落数均小于15 CFU,则对稀释度最低的平板进行计数,结果按最低稀释度典型菌落数的平均值乘以相应稀释倍数计算。
⑤ 若所有稀释度平板均无典型菌落生长,则结果按小于1乘以最低稀释倍数计算。
⑥ 若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在 15 CFU~150 CFU之间,其中一部分小于 15 CFU一部分大于 150 CFU 时,则以最接近 15 CFU或 150 CFU 的典型菌落数平均值乘以相应的稀释倍数进行结果计算。
 
四、结果报告
1、大肠埃希氏菌的菌落数小于 100 CFU 时,按“四舍五入”的原则修约,以整数报告。
2、大肠埃希氏菌的菌落数大于或等于 100 CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2 位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,保留两位有效数字。
3、若空白对照上有菌落生长,则此次检验结果无效。
4、称重取样以 CFU/g为单位报告结果,体积取样以 CFU/ml, 为单位报告结果。