方案摘要：本方案围绕猪口蹄疫（FMDV）定型 ELISA 检测全流程，深度结合 Pipetty 电动移液器 精准移液、微量分液、程序记忆等核心优势，实现96 孔板快速批量加样、匀速稳定吸排液，有效避免手动操作导致的微量体积误差、交叉污染及手法差异；标准化移液程序消除人为按压力度、吸排速度带来的操作偏差，降低长时间实验手部疲劳，显著提升 ELISA 体系配制一致性、孵育加样均一性与检测结果重复性，为猪口蹄疫病毒血清型快速定型、病原精准筛查提供高效、标准化、可追溯的操作支撑。
 
 
方案详情：
一、实验原理
       酶联免疫吸附试验（ELISA）基于抗原与抗体的特异性结合反应。在猪口蹄疫定型 ELISA 中，将各型特异性捕获抗体固定于固相载体（96 孔板）上，加入待检样品、对照抗原及相应的检测抗体。若样品中含有对应血清型的 FMDV 抗原，则会与捕获抗体结合，随后通过酶标二抗与底物的显色反应，经酶标仪读取吸光度（OD 值）来判定样品的阳性、阴性或可疑状态，从而实现病毒血清型的精准定型。
二、‌实验准备
1、器材
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 酶标仪。
③ 与96孔酶标板配套使用的旋转振荡器。
④ 恒温培养箱。
⑤ 洗板机或洗涤瓶。
⑥ 96孔平底聚苯乙烯酶标板。
⑦ “U”型96孔稀释板。
⑧ 贮液槽。
⑨ 封板膜。
 
2、试剂
① 捕获抗体:各型免抗FMDV 146S抗原抗血清，由提纯的各型FMDV 146S完整病毒粒子免疫兔子制备而成，用pH9.6的包被缓冲液将捕获抗体稀释至工作浓度；
② 检测抗体:各型豚鼠抗FMDV146S抗原抗血清，用与制备捕获抗体同源的各型FMDV146S完整病毒粒子免疫豚鼠制备而成;或者是辣根过氧化物酶(HRP)标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体，用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度；
③ 对照抗原:FMDV灭活抗原。FMDV于单层BHK-21细胞上繁殖,病毒培养液经二乙烯亚胺灭活后离心除去细胞碎片，上清液作为对照抗原，使用时用样品稀释液稀释至工作浓度；
④ 被缓冲液；
⑤ 样品稀释液；
⑥ 酶标抗体稀释液；
⑦ 洗涤缓冲液；
⑧ 底物溶液；
⑨ 终止液；
⑩ 兔抗豚鼠IgGHRP标记物。
 
三、实验步骤
1、用Pipetty电动移液器将工作浓度的捕获抗体分别包被ELISA板第1列至第12列(也可根据待检样品数量调整包被孔数),按O、A、Asia1型的顺序包被酶标板，每个血清型包被1列，每孔加50ul.用封板膜封板,置于4℃过夜或于38℃±0.5℃，100 r/min~200 r/min振荡孵育2 h。
 
2、每孔中加满洗涤缓冲液，放置30 s后弃去，重复洗涤6次后在吸水纸巾上拍干酶标板。
3、ELISA板第1列A、B两孔加O型抗原,第2列A、B两孔加A型抗原，第3列A、B两孔加Asial型抗原，以此类推，其余孔加被检样品，每份样品每个血清型加2孔，每孔加50ul。每型设2孔阴性对照阴性对照孔每孔加50ul样品稀释液。用封板膜封板置于38℃±0.5℃旋转振荡器中振荡60min。重复步骤2，洗涤。
4、将工作浓度的豚鼠抗FMDV各型抗血清逐个加入与包被兔抗FMDV血清同型的各孔，即包被兔抗型FMDV抗血清的孔则加豚鼠抗O型FMDV抗血清，包被兔抗A型FMDV抗血清的孔则加豚鼠抗A型FMDV抗血清，以此类推，使用Pipetty电动移液器连续分液模式，每孔加50ul，封板后同前振荡孵育60min。洗涤后加兔抗豚鼠IgG HRP标记物,每孔加 50ul，封板后同前振荡孵育45 min,洗涤。或者将工作浓度HRP标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体加入到包被同型兔抗血清的各孔和阴性对照孔，连续分液模式，每孔加50ul，封板后同前振荡孵育60min，洗涤。
5、加豚鼠抗FMDV各型抗血清和兔抗豚鼠IgG HRP标记物时,洗涤板子后加入预热至38 ℃±0.5℃的OPD底物溶液，连续分液模式，每孔加 50ul,封板，避光38 ℃±0.5 ℃振荡孵育15 min。连续分液模式，每孔加50ul 1.25 mol/L终止液，混匀后在酶标仪492nm下判读结果。加HRP标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体时，洗涤板子后加入预热至38℃±0.5℃的TMD底物溶液，连续分液模式，每孔加 50ul，封板，避光38℃±0.5℃振荡孵育15 min。连续分液模式，每孔加50ul 2 mol/L硫酸终止液，混匀后在酶标仪450nm下判读结果。
 

• 试验成立条件

1、结果计算:相对OD值=被检样品各血清型平均OD值一同型阴性对照(N)平均OD值。
2、某型阴性对照(N)平均OD值＞0.20，试验不成立。
3、阳性对照OD值应≥0.6,阴性对照应≤0.20,试验成立。
五、结果判定
1、在试验成立的前提下:如果样品各型的相对OD值≤0.20,则该样品为阴性;
2、如果样品某型的相对OD值≥0.3,则判定该样品此血清型阳性;
3、如果样品某型的相对 OD值＞0.2但＜0.3,则判为可疑，需要重新测定，再次测定结果，若某型的相对OD值＜0.30,则该样品为阴性，如果样品某型的相对OD值≥0.3,则判定该样品该型口蹄疫抗原阳性。