方案摘要：本方案围绕猪口蹄疫病毒（FMDV）荧光 RT-PCR从 RNA 提取、反应体系配制到批量加样全流程，深度融合 Pipetty 电动移液器精准移液、微量分液、程序锁定、匀速吸排等核心优势，实现微量核酸体系精准配制、96 孔板标准化批量加样，有效规避手动移液产生的体积误差、交叉污染与操作差异；通过标准化移液程序消除入为力度、速度偏差，降低长时间实验手部疲劳，显著提升反应体系均一性、加样重复性与荧光定量结果可靠性，为猪口蹄疫病毒快速筛查、精准分型与疫情监测提供高效、稳定、可追溯的标准化操作支撑。
 
 
 
方案详情：
一、实验原理
根据口蹄疫病毒各型共有的基因特定序列的保守片段，合成一对通用的特异性引物和一条通用的特异性探针。荧光探针的5端标记FAM荧光素，3’端标记TAMRA荧光素，3’端的猝灭基团在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号。但在扩增时，由于Taq酶的5'→3’的外切活性，在延伸到荧光探针时，将其切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生。因此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。
 
二、‌实验准备
1、器材
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② 荧光RT-PCR检测仪；
③ 高速台式冷冻离心机(离心速度12000r/min以上)；
④ 台式离心机(离心速度3000r/min)；
⑤ 混匀器；
⑥ 冰箱(2℃~8℃和-20℃两种)；
⑦ Ep管(1.5 mL)，透明薄壁 PCR管(0.2 mL)。
 
2、试剂
① 三氯甲烷；
② 异丙醇；
③ PBS；
④ 75%乙醇；
⑤ 引物:上游引物 5'-TTACAAACCTGTGATGGCCTC-3'；
下游引物 5'-CGGAGATCAACT-TCTCCTGTATG-3'；
⑥ 荧光双标记探针(10umol/L):(FAM)5'-CCTCTCCTTTGCACGCCGTGG-3'(TAMRA)；
⑦ 口蹄疫病毒通用荧光RT-PCR检测试剂盒。
 
 
三、实验步骤
1、在样本制备区进行。样品中总RNA提取的试剂盒，有商品化试剂盒出售，也可自行配制。
2、取n个灭菌的1.5ml Ep管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的数量之和，编号。
3、试用Pipetty电动移液器，单次模式，每管加入600ul裂解液。再使用连续分液模式，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200ul，一份样本换用一个吸头，连续分液模式，加入200ul三氯甲烷，混匀器上振荡混匀5s，于4℃以12000 r/min离心15 min。
 
4、取与上述步骤相同数量灭菌的1.5 mL Ep管，加入500ul异丙醇(-20 ℃预冷)，做标记。吸取各EP管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500ul，不能吸出中间层，颠倒混匀。
5、于4℃以12 000 r/min离心15 min (Ep管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干，加入600ul 75%乙醇，颠倒洗涤。
6、于4℃以12000 r/min离心10 min(Ep管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。
7、以4000 r/min离心10s(Ep管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶。
8、使用Pipetty连续分液功能，各管加入11ul DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，以2000 r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行PCR扩增;若需长期保存应放置-70℃冰箱。
 
9、从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Tag酶，在室温下融化后，以2000 r/min离心5s。设所需荧光RT-PCR检测总数为n(n=u+2+1).其中u为被检样品数、2为阳性对照数、1为阴性对照数，按表1配制反应体系混合液
 

1. 根据测试样品的数量(n)，向配制的反应体系混合液中加入n×1/2颗RT-PCR反转录酶颗粒，自动混匀模式，充分混合均匀，按每个PCR管40ul的体积，等量分装于0.2mL透明PCR管，将荧光PCR管放于96孔板上，一定要按顺序记录好被检样品管、阳性对照管、阴性对照管。转移至样本处理区。

 
11、在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加入制备好的RNA溶液10ul，盖紧管盖，500r/min离心30s。转移至检测区。
12、将离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。在96孔板内(表内)记录或填写被检样品(Unknown)、阳性对照(PC)、阴性对照(NTC)。设置探针:5'为 FAM，3’为 TAMRA。
13、第一阶段，反转录42℃，30min;第二阶段，预变性94℃，3 min;第三阶段，94℃/10 s，45 ℃/30 s，72 ℃/1min，5个循环；第四阶段，94℃/10s，60℃/30s，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光:试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
 
四、结果判定
1、结果分析条件设定直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
2、阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线，一直为水平线。
3、阳性对照的Ct值应＜28.0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合。否则，此次实验视为无效。
4、结果描述及判定
无Ct值并且无扩增曲线，表示样品中无口蹄疫病毒。
Ct值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在口蹄疫病毒。
Ct值在30.0~38.0的样品建议重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。