方案摘要：本方案围绕猪口蹄疫病毒（FMDV）多重PCR检测全流程，深度结合Pipetty电动移液器精准移液、微量分液、程序记忆等核心优势，针对多重PCR实验中微量试剂移取、体系精准配制、96孔板批量加样等关键操作环节，实现匀速稳定吸排液、精准控量分液，高效完成样本、引物、酶、缓冲液等试剂的批量加样操作。有效规避手动移液器因按压力度不均、吸排速度差异、手部抖动等人为因素导致的微量体积误差，降低实验人员长时间操作带来的手部疲劳，解决手动操作手法差异导致的实验重复性差等痛点。提升PCR反应体系配制的一致性、加样均一性，确保实验结果的稳定性与重复性，为猪口蹄疫病毒血清型快速鉴别、病原精准筛查、流行病学监测提供高效、标准化、可追溯的实验操作支撑，助力实验室提升检测效率、降低实验误差、规范操作流程。
 
 
方案详情：
二、实验原理
       猪口蹄疫多重 PCR 以 RTPCR 为基础，在单管反应体系中加入针对口蹄疫病毒不同血清型及内参基因的多对特异性引物。通过变性、退火、延伸的温度循环，对病毒 RNA 反转录后的 cDNA 进行同步扩增。各引物特异性识别对应血清型的保守基因序列，互不干扰，扩增产物片段大小不同。经电泳或荧光检测，可一次性判断是否感染口蹄疫，并快速区分血清型，同时通过内参排除假阴性，实现高效、快速、精准的分型检测。
 
二、‌实验准备
1、器材
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000及吸头；
② PCR扩增仪；
③ 台式低温高速离心机；
④ 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；
⑤ 凝胶成像仪(或紫外透射仪)；
⑥ PCR扩增管。
 
2、试剂
① 下列3条引物为上游引物:
a) 5'GAC TCG ACG TCT CCC GCC AAC T 3'；
b) 5'ACG ACG GGG GCT TTT GCT TTC AC 3'；
c) 5'CGG GAA ACG CAC GAG CAG TAT C3'。
② 下列3条引物为下游引物:
a) 5'TGC GGA CGG CCA CCT ACT ACT TC 3'；
b) 5'AGC TCC ACG AAA AAG TGT CGAG 3'；
c) 5'CGT GAT GTG GCG AGA ATG AAG AA 3'。
      ③ 总RNA提取试剂；
④ RT-PCR试剂盒；
⑤ 电泳试剂等。
      
 
三、实验步骤
1、核酸提取
a) 使用Pipetty电动移液器取待检样品、阴性对照、阳性对照各300ul分别置于1.5 mL离心管中,每管加入300ul 变SAC性液，反复混匀，冰水浴5min。
b) 设置连续分液模式，每管分别加入60ul 2mol/L乙酸钠(pH4.0)，一键混匀。
 
c) 每管加800ul苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)混合液，冰水浴5min。
d）8000r/min离心10min。将上清液转入另一洁净离心管。
e) 加800ul异丙醇，混匀，室温放置15min。
f) 4℃，12000 r/min,离心10min，小心的倒掉上清液。尽量倒干液体，留下RNA沉淀。
g) 加1000ul 75%乙醇颠倒洗涤沉淀,4℃,10 000r/min,离心5 min,小心倒干液体,室温干5 min~10 min
h) 连续分液模式，每管加10ul无核酸酶水，用于溶解RNA。总RNA提取液可立即用于PCR扩增，也可-70℃冰箱保存备用。
 2、核酸扩增
a) PCR 反应混合液配制:10×一步 RNA PCR 缓冲液 50 ul,MgCl₂  100ul， dNTPs 50ul,上下游引物对各30ul，无核酸酶水110ul，在超净工作台中混匀，分装入PCR扩增管中，一20℃保存备用。
b) 多重RT-PCR扩增:在已分装有PCR反应混合液的PCR扩增管中分别加入已制备好的总RNA提取液5ul，盖紧管盖，放入扩增仪中按照设定程序扩增:50℃反转录30min，94℃预变性2 min；然后94℃变性50 s,58℃退火 50 s,72 ℃延伸 60 s,共进行35次循环;最后72℃延伸 8 min。
3、扩增产物电泳检测
a) 1.5%琼脂糖凝胶板的制备:称取1.5 g琼脂糖,加入100 mL 1×TAE缓冲液中。加热融化后加5ul (10mg/mL)溴乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔),放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。
b) 加样:取6ul~8ul PCR扩增产物和2ul加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳同时设标准DNA Marker、阴性对照、阳性对照。
 
c) 电泳:电压 80 V~100 V或电流 40 mA~50 mA,电泳 30 min~40 min。
 
四、试验成立条件
电泳结束后，取出凝胶板置凝胶成像仪(或紫外透射仪)上观察。阳性对照电泳结果应为三个条带，分别为634 bp、483 bp和278 bp,性对照应无扩增条带。
五、结果判定
符合上述实验成立条件，被检样品至少扩增出一条DNA条带，且与阳性对照条带分子量大小相符，则该样品判定为FMDV核酸阳性。被检样品无扩增条带，判为FMDV核酸阴性。